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科研服務(wù)

SCIENTIFIC SERVICE

病毒包裝

干擾慢病毒/過(guò)表達慢病毒構建

   1.服務(wù)描述

     干擾慢病毒構建：一般情況下，RNA干擾實(shí)驗是通過(guò)化學(xué)合成小片段siRNA，或者構建shRNA表達質(zhì)粒，通過(guò)轉染試劑介導進(jìn)入細胞實(shí)現RNA干擾。但是這兩種方式對于難轉染的細胞（例如原代細胞，干細胞，懸浮細胞等）往往因為轉染效率低而導致RNA干擾實(shí)驗失敗。而通過(guò)構建慢病毒shRNA干擾質(zhì)粒并包裝病毒，再用病毒侵染靶細胞能很好的解決這一難題。
     過(guò)表達慢病毒構建：cDNA過(guò)表達慢病毒包裝是根據客戶(hù)提供的目的基因信息，將其構建至所需的慢病毒過(guò)表達載體中，與其余的慢病毒包裝輔助質(zhì)粒共同轉染HEK293T細胞包裝獲得過(guò)表達目的基因的慢病毒顆粒。

 

  2.服務(wù)內容（干擾/過(guò)表達）

  1：shRNA干擾靶點(diǎn)序列的設計/目的基因調??；

  2：shRNA 慢病毒質(zhì)粒的構建/過(guò)表達慢病毒質(zhì)粒的構建；

  3：shRNA慢病毒包裝與病毒滴度測定/過(guò)表達慢病毒包裝與病毒滴度測定；

 

  3.服務(wù)說(shuō)明

   1：我們的RNA干擾及過(guò)表達服務(wù)針對所有的哺乳動(dòng)物細胞，暫不提供植物和原核生物的RNA干擾服務(wù)；

   2：對象可以是編碼蛋白的mRNA序列，也可以是長(cháng)的非編碼RNA(lncRNA)序列；

   3：針對不同的靶基因，我們一般設計3-4條干擾序列，保證至少有一條序列干擾效果大于70%（RNA水平）。也可由客戶(hù)提供干擾靶點(diǎn)，但我們不保證干擾效果；

   4：我們提供多個(gè)慢病毒載體供客戶(hù)選擇（見(jiàn)下方載體信息）；

   5：我公司包裝的shRNA干擾慢病毒顆粒滴度可以達到1×109TU/ml，完全能夠滿(mǎn)足動(dòng)物實(shí)驗；


  4.客戶(hù)所得

    1：構建好的shRNA/過(guò)表達質(zhì)粒及對照質(zhì)粒；

   2：合同規定量的慢病毒顆粒及對照病毒顆粒；

   3：完整的實(shí)驗報告（包括實(shí)驗材料，實(shí)驗步驟，實(shí)驗結果等）；


5.載體信息

   干擾慢病毒構建從靶點(diǎn)設計到慢病毒滴度測定完成需21個(gè)工作日；

    過(guò)表達慢病毒構建從基因調取到慢病毒滴度測定完成需27個(gè)工作日；

 

 

miRNA 的過(guò)表達慢病毒包裝

1.服務(wù)描述

　　microRNA(miRNA)是一類(lèi)小片段單鏈RNA , 最初是在核內由RNA聚合酶轉錄形成具有帽子結構(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAA)的pri-miRNA，pri-miRNA在核酸酶Drosha及其輔助因子Pasha的作用下被處理成約70個(gè)核苷的pre-miRNA。pre-miRNA被運輸出核后再由另外一個(gè)核酸酶Dicer將其剪切形成約22個(gè)核苷酸的成熟miRNA。成熟的miRNA 與RISC組裝成RNA誘導的沉默復合體，通過(guò)堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。

　　

 

圖示：miRNA的成熟過(guò)程

 

　　2.服務(wù)內容

　　1：miRNA 的過(guò)表達慢病毒包裝

　　我公司采用擴增pri-miRNA及其兩端的天然側翼序列來(lái)構建miRNA的過(guò)表達質(zhì)粒，并包裝慢病毒。以實(shí)現miRNA在體外(內)的高表達。該方法相比化學(xué)合成的miRNA，具有可持續性表達，并且能用于難轉染(例如干細胞，懸浮細胞等)細胞等優(yōu)點(diǎn)。比pre-miRNA和mature miRNA 形式的過(guò)表達，具有表達效果更好，更能模擬體內天然的成熟過(guò)程。

　　2：miRNA的抑制

　　我公司采用TuD RNA(Tough Decoy RNA)的設計方法構建miRNA的抑制慢病毒載體。TuD RNA不同于以往的單鏈RNA，它是含有頸環(huán)結構的雙鏈RNA , 能夠抵抗胞內核酸酶的降解，讓miRNA抑制可持續一個(gè)月以上。并且，TuD RNA的兩條鏈都包含一個(gè)miRNA結合位點(diǎn)，能夠更高效地隔離濃度較低的目標miRNA。因此，相比其它方法，TuD RNA能夠更長(cháng)效的抑制miRNA。

　　

 

圖示：TuD RNA的工作原理

 

　　3：miRNA的靶基因驗證

　　由于miRNA是通過(guò)其seed sequence(5’端2-8位核苷酸)與靶基因的3’UTR結合抑制靶基因的表達。因此，我們將待定目的基因的3’UTR區域構建至報告基因luciferase的后面，通過(guò)比較實(shí)驗組和對照組報告基因表達的改變(監測熒光素酶的活性變化)來(lái)間接反映miRNA對目的基因的抑制作用。同時(shí)結合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確認miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

 

　　3.服務(wù)說(shuō)明

　　1：客戶(hù)只需提供miRBase數據庫中的miRNA編號，我們就可以按照您的要求完成相關(guān)實(shí)驗。

　　2：miRNA的過(guò)表達效果受諸多因素影響，與對照組相比，可以提高2—1000倍(如果本底表達水平較低，可以達到較好的過(guò)表達效果，如果本底表達水平較高，過(guò)表達效果會(huì )相對較低)。

　　3：我們提供多個(gè)microRNA慢病毒載體供客戶(hù)選擇(見(jiàn)下方載體信息);

 

　　4.客戶(hù)所得

　　1：符合客戶(hù)要求的產(chǎn)品(質(zhì)粒+甘油菌 或者 病毒+polybrene);

　　2：完整的電子版實(shí)驗報告(包括實(shí)驗材料，步驟，載體圖譜等);

　　3：完整的測序報告;

 

　　5.載體信息

 

載體編號

攜帶標記

載體骨架主要元件

熒光

真核抗性

MicroRNA過(guò)表達慢病毒載體

pHY-LV-miR1.1

無(wú)

無(wú)

CMV-GFP-MCS

pHY-LV-miR1.2

GFP

無(wú)

CMV-GFP-MCS-PGK- Puromycin

MicroRNA抑制慢病毒載體

pHY-LV-KD1.1

GFP

無(wú)

U6-TuD RNA-CMV-GFP

pHY-LV-KD1.2

RFP

無(wú)

U6- TuD RNA -CMV-RFP

pHY-LV-KD1.4

無(wú)

puromycin

U6- TuD RNA -CMV-Puromycin

pHY-LV-KD2.1

GFP

無(wú)

U6- TuD RNA -EF1α-GFP

pHY-LV-KD3.1

GFP

無(wú)

U6- TuD RNA -UBC-GFP

pHY-LV-KD5.1

GFP

puromycin

U6- TuD RNA -CMV-GFP-PGK- Puromycin

pHY-LV-KD5.2

RFP

puromycin

U6- TuD RNA -CMV-RFP-PGK- Puromycin

pHY-LV-KD5.4

GFP

puromycin

U6- TuD RNA -UBC-GFP-PGK- Puromycin

3’UTR報告基因慢病毒載體

pHY-LV-Report3.1

luciferase

無(wú)

CMV-luciferase-MCS