移植性腫瘤動(dòng)物模型已被廣泛運用于腫瘤生長(cháng)和轉移機制研究，抗腫瘤藥物篩選和新藥評估等領(lǐng)域【1】。目前，近親繁殖的同系小鼠和免疫缺陷型小鼠都是成熟的移植性腫瘤動(dòng)物模型【2】。但小鼠模型也存在不足，例如小鼠的飼養成本較高，需要的飼養空間較大；并且小鼠的皮毛阻礙了在體腫瘤細胞的成像。因此，一些研究者將注意力轉向將斑馬魚(yú)作為移植性腫瘤動(dòng)物模型。

斑馬魚(yú)作為研究模型具有很多優(yōu)點(diǎn)：斑馬魚(yú)與人類(lèi)基因同源性高達85%，其信號傳導通路與人類(lèi)基本近似；生殖能力強，生殖方式為體外受精，方便大量篩選；飼養成本低，為小鼠的十分之一到百分之一；個(gè)體小，幼魚(yú)體長(cháng)為1-2mm；透明，方便進(jìn)行觀(guān)察；遺傳操作系統成熟，敲降，敲除，轉基因技術(shù)都可實(shí)現【3】。

盡管多種移植腫瘤已在斑馬魚(yú)模型上建立，包括T、B細胞白血病，急性骨髓性白血病，黑色素瘤，神經(jīng)細胞瘤等，但斑馬魚(yú)作為移植性腫瘤的模型仍有很大的局限。比如，斑馬魚(yú)的培養溫度一般低于34℃，影響腫瘤細胞的生長(cháng)；斑馬魚(yú)免疫系統在胚胎發(fā)育的第21天完全成熟，限制實(shí)驗時(shí)間；而斑馬魚(yú)胚胎只允許注射25-100個(gè)腫瘤細胞，阻礙了長(cháng)期移植腫瘤實(shí)驗的進(jìn)行【4】。因此，腫瘤移植斑馬魚(yú)模型需要進(jìn)一步改進(jìn)。

2019年4月25日，來(lái)自馬薩諸塞州綜合醫院研究所的David M.Langenau團隊在Cell上發(fā)表了腫瘤移植斑馬魚(yú)模型的最新研究成果 Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Responses in Immunodeficient Zebrafish 。文章中，作者使用免疫系統缺陷的斑馬魚(yú)，建立并評估了37℃培養條件下的腫瘤移植斑馬魚(yú)模型。利用該模型，研究人員從單細胞水平考察了橫紋肌瘤的增殖和遷移情況，可視化地檢測了聯(lián)用奧拉帕尼（olaparib）和替莫唑胺（temozolomide）治療橫紋肌瘤的效果，最終為臨床前階段腫瘤治療提供新的可靠的模型。

敲除斑馬魚(yú)的基因prkdc (protein kinase DNA-activated catalytic polypeptide) 及il2rga(interleukin-2 receptor gamma a）（prkdc-/-,il2rg-/-），會(huì )造成T、B細胞和自然殺傷（Nature killer, NK） 細胞的缺陷【5】。作者飼養該品系斑馬魚(yú)生長(cháng)2至3個(gè)月，更換至含有抗生素的37℃的水中進(jìn)行培養直到6個(gè)月，在這段時(shí)間內建立腫瘤移植模型。作者移植了16中不同的腫瘤細胞，包括黑色素瘤，腎細胞癌，慢性髓系白血病細胞，套細胞淋巴瘤等一系列惡性腫瘤，都獲得較高的移植率，并且腫瘤細胞都存在超過(guò)28天，受體斑馬魚(yú)的死亡率小于15%。作者還從組織病理學(xué)和細胞形態(tài)學(xué)角度評估了移植后的腫瘤細胞，證明與腫瘤移植金標準NSG小鼠（NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1WjI/SzJ）模型相比，移植到斑馬魚(yú)體內的腫瘤細胞在標記基因的表達，生長(cháng)速率和凋亡水平都相似（圖1）。

圖1：人胚胎橫紋肌瘤在腫瘤移植斑馬魚(yú)和NSG小鼠模型的生長(cháng)，病理和凋亡情況。

作者還成功地移植了6種病人來(lái)源的腫瘤，建立了病人腫瘤細胞的移植模型，從而使臨床前階段檢測治療方案的效果變得可行，為實(shí)現腫瘤病人的個(gè)性化治療奠定了基礎。

腫瘤細胞的高度異質(zhì)性促使研究者在單細胞水平研究腫瘤的生長(cháng)、轉移和治療抵抗。作者將橫紋肌瘤細胞移植到斑馬魚(yú)的眼周肌肉，并標記可光轉換的H2b-Dendra2蛋白，通過(guò)追蹤發(fā)現橫紋肌瘤細胞可分為三種：高度遷移性細胞，增殖性細胞和靜息性細胞，并且增殖性細胞能單向轉化為高度遷移性細胞，證明移植性腫瘤斑馬魚(yú)模型可進(jìn)行腫瘤單細胞水平的研究。

為將腫瘤移植斑馬魚(yú)建立成為臨床前治療模型，作者檢測了聯(lián)用PARP（poly-ADP-ribose polymerase）抑制劑奧拉帕尼和誘導DNA損傷的替莫唑胺對治療橫紋肌肉瘤的效果，結果發(fā)現在斑馬魚(yú)模型中，單獨使用一種藥物不具有明顯的治療效果，但二者聯(lián)用則明顯的抑制了腫瘤的生長(cháng)。而在NSG模型中也出現相同的效應，也說(shuō)明了斑馬魚(yú)作為腫瘤治療模型的可靠性。

進(jìn)一步，作者在腫瘤移植斑馬魚(yú)模型中，使用不同顏色的熒光蛋白標記細胞周期，發(fā)現聯(lián)用奧拉帕尼和替莫唑胺將橫紋肌肉瘤細胞抑制在G2期，為鑒定藥物治療腫瘤的機制指明了方向。

綜上，作者建立了新的腫瘤移植斑馬魚(yú)模型，能夠可靠的重現多種病人來(lái)源的腫瘤生長(cháng)，轉移和凋亡情況。斑馬魚(yú)通體透明的特點(diǎn)決定該模型能方便使用熒光標記進(jìn)行腫瘤研究。并且，作者將斑馬魚(yú)模型用于臨床前治療效果的檢測，為腫瘤病人的個(gè)性化治療奠定基礎（圖2）。

圖2

文章通訊作者為David M.Langenau副教授，其實(shí)驗室長(cháng)期致力于移植性腫瘤的斑馬魚(yú)模型研究。第一作者為實(shí)驗室成員Chuan Yan, Dalton C. Brunson，Qin Tang和Daniel Do。

 Langenau實(shí)驗室成員合影

原文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.04.004