A:有脫靶機會(huì )，但通常識別活性會(huì )比較低，一般地，脫靶是需要盡量避免的。如果想要敲除兩個(gè)以上基因，需要針對要敲除的基因分別設計crispr以制備不同的sgRNA。 

2.

Q:crispr/Cas13在gRNA設計上有什么要注意的嗎？是否可以保留cas9所用的80bp骨架只更換gRNA？

A:Cas13的sgRNA與cas9的完全不同，不能使用cas9對應的sgRNA骨架。

3.

Q:sgRNA的骨架與靶點(diǎn)CRISPR的結合緊密程度是否會(huì )影響打靶的效率？

A:sgRNA的骨架序列并不與crispr（基因組上的特定DNA序列）結合，識別crispr序列的是102nt（20+82 nt）sgRNA中的前20 nt（gRNA序列），通過(guò)gRNA與crispr序列的互補識別，sgRNA引導Cas9靶向切割crsipr中3'側（靠近PAM即NGG）的3至4 nt間的3‘-5’磷酸二酯鍵，形成雙鏈斷裂（DSB）。

4.

Q:請問(wèn)我設計人基因的sgRNA的時(shí)候，發(fā)現保守結構域所在的外顯子很少有比較高得分的，甚至說(shuō)很低，請問(wèn)這種情況應該怎么辦?

A:crispr評分問(wèn)題，綠色沒(méi)有問(wèn)題，黃色勉強能用，紅色不能用（估計是在基因組中有相同序列，1個(gè)sgRNA將識別多于1個(gè)靶向位點(diǎn)，脫靶問(wèn)題驗嚴重），實(shí)在為難的話(huà)，可crispr設計的區域提前到前一個(gè)外顯子。另外，建議使用CCTOP軟件設計crispr

Q:我們也在使用CCTOP這個(gè)軟件，但是發(fā)現有時(shí)排名靠前的卻評分為中等或低，不知道如何選擇。

A:評分的高低只是參考，medium應該是不錯的。那個(gè)評分是來(lái)自一篇研究論文，如果閱讀原文，你會(huì )發(fā)現數據的樣本量不是太大，且相關(guān)系數不是太大。所以效率評分僅作參考。選擇crispr時(shí)，不能在基因組中存在明顯的脫靶位置的序列。

Q:那么CCTOP選擇是優(yōu)先考慮排名是嗎？例如從T1-T2-T3...

A:還是優(yōu)選那些脫靶機會(huì )低的crispr，（看候選脫靶序列的相似性，盡可能選那些候選脫靶序列具3個(gè)mismatch的，然后在按效率的高低選。

 

5.

Q:如果做RT-PCR驗證，引物是不是需要特異性針對設計sgRNA對應的轉錄本？

A:是的，需要將靶向突變位置的cDNA擴增出來(lái)，注意，由于擔心基因組上基因組序列的改變可能會(huì )影響原始mRNA的剪接，因此，設計引物時(shí)，最好是在目標序列的前面和后面的外顯子上分別設計正反向引物。

6.

Q:我做了一個(gè)CRISPR的基因敲除，目前在挑單克隆時(shí)送測了24個(gè)，亞克隆的情況多數出現兩組峰：一組是非移碼突變的，一組是有突變的（插入一個(gè)堿基或者突變成其它氨基酸），請問(wèn)這種情況是我克隆沒(méi)挑夠還是基因本身的生理原因造成的??？

A:單克隆測序應該不會(huì )出現“兩組峰”！你是將細胞克隆的基因組DNA的PCR產(chǎn)物直接送測序？還是將其亞克隆后再挑選陽(yáng)性轉化子去測序的？如果是后者，你是否想說(shuō)你的陽(yáng)性轉化子克隆測序結果表明：一組（若干個(gè)克?。榉且拼a突變，一組（24個(gè)克隆中的另外一些克?。┦怯型蛔兊模ú迦胍粋€(gè)堿基）？

Q:是的，是亞克隆測序，一組為非移碼突變，一組為突變。我送了十個(gè)單克隆出去測TA都是這個(gè)樣子，我想說(shuō)，能不能把之前的sgRNA的病毒再感染一下這些單克隆，可否拿到雙槍的結果？

A:?你首先需要確認原先的sgRNA識別的序列在候選細胞克隆的基因組序列中是否已被突變？如果已經(jīng)突變了，則sgRNA無(wú)法再次發(fā)揮左右（一般地，如果已經(jīng)發(fā)生突變即使是非移碼突變，其crispr序列應該已經(jīng)突變）。

7.

Q:我想請問(wèn)下sgRNA設計中，有些網(wǎng)站把PAM序列也弄到sgRNA里了，有些網(wǎng)站又沒(méi)有，那我們設計sgRNA的時(shí)候需要把PAM也加進(jìn)去嗎？

A:常用CRISPR設計軟件

1、http://crispr.mit.edu

2、http://crispr.cos.uniheidelberg.de/index.html

3、http://crispor.tefor.net/

4、http://www.rgenome.net/cas-designer/

5、http://zifit.partners.org/ZiFiT/

這里需要區別兩個(gè)名詞：CRISPR vs sgRNA；一些文獻常將這兩個(gè)詞混用（我們最初的培訓講義也是混用的）。實(shí)際上，sgRNA是RNA形式的分子。在基因組編輯中，sgRNA引導Cas9靶向識別CRISPR序列，其中的PAM（CRISPR序列臨近的3個(gè)核苷酸NGG為PAM）作為CRISPR序列在基因組上的一個(gè)標記，對于靶向識別至關(guān)重要，靶向識別的結果是Cas9的兩個(gè)核酸內切酶結構域(兩把”分子剪刀“)將PAM前的3-4核苷酸間的3'-5’磷酸二酯鍵切斷，造成DSB（雙鏈斷裂）。DSB出現后，誘發(fā)細胞針對該DSB進(jìn)行NHEJ或HR修復，產(chǎn)生不同編輯子。篩選不同的編輯子，有希望獲得KO或KI的等位基因。從上述描述可以看出，CRISPR序列是一個(gè)DNA序列（不包括PAM），而由此合成的sgRNA則是用來(lái)識別該DNA序列的。張鋒把CRISPR + PAM 序列稱(chēng)作Guide 序列，我們在講課中使用這一說(shuō)法。在使用軟件設計CRISPR序列時(shí)，需要將目標DNA序列（包括假定的PAM序列）都輸入，如果沒(méi)有PAM，就不可能設計出CRISPR序列。

Q:那還有一個(gè)問(wèn)題老師，我想請問(wèn)下軟件里設計的sgRNA會(huì )不會(huì )有的是反義鏈上的序列呢，如果有的話(huà)我們需要把它互補配對回來(lái)再加CACC(g)嗎？是否只需要直接在給出的序列前面加CACC（g)就行？

A:加什么序列取決于你使用的驅動(dòng)sgRNA表達的空載體中啟動(dòng)子的序列，CACC應該是人U6啟動(dòng)子的最后4個(gè)核苷酸序列。

 

8.

Q:用T7啟動(dòng)子資料說(shuō)轉錄起始位點(diǎn)是G或A ，但是ZiFiT網(wǎng)站是GG，是不是三個(gè)都可以，要是20個(gè)核苷酸的CRISPR序列首位不是這三個(gè)G, A或者GG, 自己手動(dòng)添加到里面是不是也可以？

A:CRISPR序列一般以G開(kāi)頭，這是由于轉錄自嘌呤（主要是G，有時(shí)為A)開(kāi)始（是為轉錄起始位點(diǎn)）。如果crispr（20nt）序列的前2 nt是GG，在以T7啟動(dòng)子（前17 nt)為驅動(dòng)的體外轉錄中，當然是最好，如果crispr（20 nt)不是以G開(kāi)頭，可以加1-2個(gè)G（一般加1個(gè)G即可），多了1-2G的sgRNA被證明不影響引導常用Cas9（spCas9）識別crispr序列的活性，但不能有效引導espCas9（保真版Cas9）識別crispr序列。

9.

Q:如果U6啟動(dòng)子啟動(dòng)轉錄多了一部分序列會(huì )對sgRNA的轉錄及效率產(chǎn)生影響嗎？就是：U6+一小段序列+BbsI-sgRNA-BbsI這樣的設計，這一小段序列對整個(gè)結構的影響很大嗎？

A:轉錄本身可能沒(méi)有什么問(wèn)題，但轉錄產(chǎn)物不是你原來(lái)設計的sgRNA。最近有報道說(shuō)多出來(lái)幾個(gè)nt可能對引導spCas9識別crispr序列影響不大，但是你提出的這種設計方式顯然不是推薦的方式，其結果是很可能不能獲得你期待的基因組編輯作用?。

Q:看測序結果的時(shí)候我們應該看哪里，理想中的是在設計的三個(gè)sgRNA的位點(diǎn)出突變嗎？還是在某個(gè)sgRNA附近突變也可以。

A:DSB一般出現在PAM前的3-4bp之間。NHEJ修復在此發(fā)生，因此，Indel突變（插入缺失突變）主要發(fā)生在位置的附近，當然也會(huì )有較大（甚至更大）片段刪除的情況出現。每個(gè)crispr位置都可能出現突變（如果對應的sgRNA都有活性的話(huà)）。但當有活性的sgRNA同時(shí)出現時(shí)，造成大片段刪除的機會(huì )大增。在這種情況下，常常仍能發(fā)現indel突變發(fā)生在每個(gè)crispr位置上的痕跡（即突變主要出現在PAM前的3-4bp附近）。

10.

Q:一個(gè)基因上如果我同時(shí)對2個(gè)sgRNA位點(diǎn)進(jìn)行編輯,這兩個(gè)sgRNA距離多遠合適？是最好在同一個(gè)外顯子上嗎？

A:你的目的是希望敲除這個(gè)基因，還是希望制造出兩個(gè)Indel突變位點(diǎn)？如果是前者，我們建議二者之間的距離不要超過(guò) 200 bp (越近越好）。如果是后者，則建議相距200 bp之外，越遠越好。

 

 

 

 

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