斑馬魚(yú)模型用于研究人類(lèi)基因功能的一般策略
發(fā)布時(shí)間:
2018-12-06
斑馬魚(yú)模型用于研究人類(lèi)基因功能的一般策略
作為優(yōu)選的模式脊椎動(dòng)物，斑馬魚(yú)模型可以用來(lái)評價(jià)人類(lèi)基因的作用與功能、解析其在遺傳與
發(fā)育上發(fā)揮作用的分子機制。如果候選基因與疾病高度相關(guān)，斑馬魚(yú)模型則可以用來(lái)幫助確認疾病
的致病基因，通過(guò)基因組改造（基因敲除、敲入和轉基因等）構建人類(lèi)疾病的斑馬魚(yú)模型，表型模
擬人類(lèi)疾病的病癥，進(jìn)而用于研究分子遺傳病的病理機制、篩選治療疾病的化學(xué)藥、開(kāi)發(fā)基因治療
的生物藥等生物醫藥的研發(fā)。
一、在斑馬魚(yú)胚胎中過(guò)表達目標基因（野生型vs 突變型等位基因）評價(jià)基因功能（暫時(shí)性）
如果目標基因在人類(lèi)疾病中過(guò)表達，或者想了解突變基因可能的功能（包括功能缺失或功能獲
得），可以通過(guò)借助顯微注射技術(shù)在斑馬魚(yú)胚胎中過(guò)表達目標基因（野生型vs 突變型等位基因，
基本方法為：克隆人類(lèi)目標基因、體外轉錄制備mRNA，將mRNA 顯微注入斑馬魚(yú)受精卵），將斑
馬魚(yú)胚胎當作一個(gè)體內反應器，建立暫時(shí)性的體內模型，從胚胎顯微行為學(xué)、顯微形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細胞生物學(xué)、轉錄組學(xué)等不同水平評價(jià)目標基因的功能及可能的作用機制。具體的評價(jià)策略需在對目標基因的個(gè)性化特征分析后確定。我們已有的工作積累表明，轉錄組分析是一種常用的比較有效的機制解析策略，通過(guò)選擇發(fā)育至合適時(shí)期的注射胚胎（需結合基因的特征進(jìn)行評價(jià)后選擇），提取總RNA，進(jìn)行轉錄組測序，從而有機會(huì )在轉錄組水平上無(wú)偏好地整體評價(jià)目標基因的功能（包括但不限于對特定生物學(xué)過(guò)程的影響、對特定信號通路的影響、對特定基因的可能調控作用）。基于上述研究目的時(shí)，即使待研究的人基因在斑馬魚(yú)中沒(méi)有同源基因，也可以根據已知目標基因的保守生物學(xué)功能（只要斑馬魚(yú)胚胎也存在類(lèi)似的生物學(xué)過(guò)程），利用斑馬魚(yú)胚胎評價(jià)其功能。
二、在斑馬魚(yú)胚胎中敲降目標基因評價(jià)人同源基因功能（暫時(shí)性）
如果目標基因在斑馬魚(yú)基因組中有直系同源基因，那么就可以在斑馬魚(yú)胚胎中敲降目標基因，
評價(jià)人同源基因功能。如果選擇敲降目標基因的話(huà)，需要首先明確目標基因在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育中有表達。如果目標基因在早期胚胎中沒(méi)有表達，毫無(wú)疑問(wèn)敲降斑馬魚(yú)的同源基因，不可能獲得有用的信息。目標基因在斑馬魚(yú)上的早期表達，可通過(guò)RT-PCR 和胚胎整體原位雜交來(lái)檢測。RT-PCR 可以給出基因的發(fā)育時(shí)期特異性的表達模式（但缺乏組織特異性或空間特異性表達信息），而胚胎整體原位雜交則可以獲得時(shí)空特異性表達的全部信息。至于目標基因如果存在a 和b 兩個(gè)拷貝的情況，建議首先通過(guò)原位雜交確認那個(gè)拷貝的表達模式可能與感興趣的發(fā)育事件有關(guān)，如果胚胎整體原位雜交結果表明兩個(gè)基因均與可能與感興趣的發(fā)育事件有關(guān)，則需要同時(shí)敲降（一般安排敲降a、敲降b、敲降a+b 三組實(shí)驗）。在實(shí)踐工作中，還可能遇到斑馬魚(yú)的同源基因只是預測的結果，在這種情況下，需要首先克隆該基因（CDS 全序列）或至少該基因的部分CDS 序列（可借組于EST 序列信息）。在確定目標基因在斑馬魚(yú)早期胚胎發(fā)育中有表達后，需要建立基因敲降的方法。斑馬魚(yú)基因敲降（knock down）策略為：1）使用兩個(gè)MO，其中一個(gè)與AUG 附近序列互補，抑制mRNA 翻譯，該MO 無(wú)需驗證有效性（活性），其是否具有活性只能通過(guò)敲降后的胚胎表型來(lái)確定；另一個(gè)與內含子-外顯子連接處序列互補，抑制原始mRNA 的剪接，該MO 的有效性（活性）可以通過(guò)RT-PCR加以確認；而兩個(gè)MO 的特異性通常是通過(guò)設計相應的5-堿基錯配MO 作為對照來(lái)實(shí)現的；2）MO
加CRISPRi，其中的MO 為前述可抑制原始mRNA 的剪接的MO，CRISPRi 方法則是通過(guò)多個(gè)sgRNA
（一般建議4 個(gè)）引導dCas9 抑制目標基因的轉錄，從而實(shí)現目標基因的敲降；無(wú)論哪一種策略，
只有在兩種敲降方法得出的表型一致，且其異常表型可被mRNA 拯救的情況下，才可以被認定敲降
結果可靠。一般地，推薦使用策略2，因為策略2 中的兩種方法一個(gè)在轉錄后水平、一個(gè)在轉錄水
平（且一般認為CRIPSRi 的脫靶和毒性小于MO），因而結果的可信度更高。在確認了基因敲降的方法后，可以前述同樣的策略評價(jià)基因的功能及解析可能的分子機制。即：從胚胎顯微行為學(xué)、顯微形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、細胞生物學(xué)、轉錄組學(xué)等不同水平評價(jià)目標基因的功能及可能的作用機制。具體的評價(jià)策略需在對目標基因的個(gè)性化特征分析后確定。我們已有的工作積累表明，轉錄組分析是一種常用的比較有效的機制解析策略，通過(guò)選擇發(fā)育至合適時(shí)期的注射胚胎（需結合基因的特征進(jìn)行評價(jià)后選擇），提取總RNA，進(jìn)行轉錄組測序，從而有機會(huì )在轉錄組水平上無(wú)偏好地整體評價(jià)目標基因的功能（包括但不限于對特定生物學(xué)過(guò)程的影響、對特定信號通路的影響、對特定基因的可能調控作用）。
三、構建基因敲除斑馬魚(yú)模型研究目標基因的功能（永久性）
如果期待通過(guò)功能缺失解析基因功能，那么構建基因敲除斑馬魚(yú)模型則是一種常見(jiàn)的選擇?；?/div>
因敲除的方法包括CRISPR/Cas9 或者TALEN，常用CRISPR/Cas9。功能研究方案同前。
四、構建轉基因斑馬魚(yú)模型研究目標基因的功能（永久性）
如果期待通過(guò)功能獲得解析基因功能，那么制備轉基因斑馬魚(yú)模型則是一種常見(jiàn)的選擇。轉基
因方法為T(mén)ol2 策略。功能研究方案同前。
五、構建基因敲入斑馬魚(yú)模型研究目標基因的功能（永久性）
人類(lèi)分子遺傳病中很多是源于點(diǎn)突變或者小片段插入缺失造成的基因突變。在這種情況下，構
建基因敲入斑馬魚(yú)模型研究目標基因的功能是一種常見(jiàn)的選擇。要建立基因敲入模型，首先要進(jìn)行
氨基酸水平上的保守性分析。只有氨基酸水平上是高度保守的，才可以考慮基因敲入（相對而言，
這種保守性在不少直系同源基因上并不好）。
另外，還需要特別提醒的是：目前斑馬魚(yú)的基因敲入技術(shù)非常不成熟，基因敲入的成本高且風(fēng)
險極大。需要謹慎抉擇。（公司目前暫不接受一般客戶(hù)訂單，VIP 客戶(hù)在充分了解分析后，按共擔
成本的方法嘗試敲入項目）。功能研究方案同前。
南京堯順禹生物科技有限公司
2018-12-02
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